大家好,我是小新,我来为大家解答以上问题。退火温度过高过低有什么影响,退火温度很多人还不知道,现在让我们一起来看看吧!
1、退火温度低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃。
退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值(Tm值=4(G+C) +2(A+T))为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
2、延伸时间:1min/kb(10kb内)。
引物延伸一般在72℃进行(Taq酶最适温度)。但在扩增长度较短且退火温度较高时,本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定,一般推荐在1000bp以上,含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
扩展资料
PCR的过程:
1、DNA变性:(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA
2、退火:(60℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3、延伸:(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。
参考资料来源:搜狗百科—PCR
本文到此讲解完毕了,希望对大家有帮助。